中华人民共和国农业行业标准--固氮菌肥料

中華人民共和國農業行業標準

固氮菌肥料

Azotobacter fertilizer

2000-12-22發布 2001-04-01實施

中華人民共和國農業部發布

前言

本標準在原有標準 NY227-1994《微生物肥料》的基礎上，對其中的固氮菌肥料部分進行修改。

主要修改內容如下：

—在技術要求中刪除成品無害化指標；

—在檢驗方法中增加允許差，并增加抽樣和判定規則。

本標準自實施之日起，同時代替 NY227-1994中的固氮菌肥料部分。

本標準的附錄 A、附錄B、附錄C都是標準的附錄。

本標準由中華人民共和國農業部提出。

本標準起草單位：農業部微生物肥料質量監督檢驗測試中心、中國農業科學院土壤肥料研究所。

本標準主要起草人：李元芳、吳觀以、李慧荃、葛誠、沈德龍。

固氮菌肥料

Azotobacter fertilizer

1 范圍

本標準規定了固氮菌肥料的分類、技術要求、檢驗方法、檢驗規則、標志、包裝、運輸、貯存等。

本標準適用于含有益的固氮菌、能在土壤和多種作物根際中固定空氣中的氮氣 ,供作物氮素營養,又能分泌激素剌激作物生長的活體制品。本標準也適用于以固氮菌為主的含有能促進固氮、生長的植物促生根際細菌(PGPR)的復合固氮菌肥料。

2 引用標準

下列標準所包含的條文，通過在本標準中引用而構成為本標準的條文。本標準出版時，所示版本均有效。所有標準都會被修訂，使用本標準的各方應探討使用下列標準最新版本的可能性。

GB/T 625一1989 化學試劑硫酸

GB/T 629一1997 化學試劑氫氧化鈉

GB/T 1250一1989 極限數值的表示方法和判定方法

GB/T 6543一1986 瓦愣紙箱

GB/T 6682一1992 分析實驗室用水規格和試驗方法

3 定義

本標準采用下列定義：

3.1 自生固氮菌

在土壤里能固定空氣中的氮，供作物氮素營養，又能分泌激素刺激作物生長的微生物。

3.2根際聯合固氮菌

既依賴根際環境生長，又在根際中固定空氣中的氮氣，對作物的生長發育產生積極作用的微生物。

3.3 固氮效能

固氮菌每消耗 1g碳水化合物（糖）從空氣中攝取氮素的毫克數，固氮效能用mg氮/g糖表示。

4 產品分類

4.1 按形態不同，分為液體固氮菌肥料、固體固氮菌肥料和凍干固氮菌肥料。

4.2 按菌種及特性分為：自生固氮菌肥料、根際聯合固氮菌肥料、復合固氮菌肥料。

5 技術要求

5.1 菌種

在含一種有機碳源的無氮培養基中能固定分子氮，并具有一定固氮效能。菌體一般為短桿狀（固氮螺菌屬菌體呈螺旋狀），革蘭氏染色陰性。

5.1.1 自生固氮菌

用固氮菌屬（ Azotobacter）、氮單胞菌屬（Azomonas）的菌種，也可用莖瘤根瘤菌（Azorhizobium）和固氮芽孢桿菌（Paenibacillus azotofixans）的菌株。

5.1.2 根際聯合固氮菌

可用下列菌種：固氮螺菌（ Azospirillum）；陰溝腸桿菌（Enteroba）經鑒定為非致病菌的菌株；糞產堿菌（Alcaligenes faecalis）經鑒定為非致病菌的菌株；肺炎克氏桿菌（Klebseilla pneumoniae）經鑒定為非致病菌的菌株。

使用本準則規定之外的菌種生產固氮菌肥料時，菌種必須經過鑒定，并符合 5.1要求。

生產固氮微生物肥料所使用的菌種，必要時還要進行菌種染色鑒別（見附錄 B）和菌種固氮效能測定（見附錄C）。

5.2 成品技術指標(見表1)

表 1 成品技術指標

項目
液體
固體
凍干

外觀、氣味
乳白或淡褐色液體，渾濁，稍有沉淀，無異臭味
黑褐色或褐色粉狀，濕潤、松散，無異臭味
乳白色結晶，無味

水分， %
-
25.0 ~ 35.0
3.0

pH值
5.5 ~ 7.0
6.0 ~ 7.5
6.0 ~ 7.5

細度，過孔徑 0.18mm標準篩的篩余物，% ≤
2
20.0
-

有效活菌數，個 /ml

(個/g、個/瓶 ) ≥
5.0×10 8
1.0×10 8
5.0×10 8

雜菌率 1）， % ≤
5.0
15.0
2.0

有效期 2），月 ≥
3
6
12

1）其中包括10 -6 馬丁培養基平板上無霉菌。

2）此項僅在監督部門或仲裁檢驗雙方認為有必要時才檢測。

6 抽樣

按每一發酵罐菌液制成的產品為一批，逐批抽樣檢驗。抽樣過程要嚴格避免雜菌污染。 6.1 抽樣工具及用品

抽樣前預先準備好無菌塑料袋 (或塑料瓶)、金屬勺、剪刀、封口機(或封口膠帶)、牛皮紙封樣袋、標簽、抽樣封條和膠水。

6.2 抽樣數量及抽樣方法

在成品庫抽樣，按“ ”形分層設點抽樣，抽樣以件為單位，小包裝產品以一包裝箱為一件。大包裝（30-50kg）產品以一袋（或一桶）為一件。抽樣基數由樣品基數的大小確定。1-10件，全部抽樣。11-200件，抽樣10件；201-400件，抽取20件。樣品基數大于400件，按照超過部分的2%增加抽樣件數。總件數不超過40件。

每件小包裝產品抽取一小袋，在無菌條件下每袋取樣 200g。將所有樣品混勻，按四分法縮到2000g，分裝4袋，然后封口。每2袋為一份裝入牛皮紙封樣袋。

液體產品每件吸取 10mL，一同防入無菌的三角瓶中，混勻后分成兩份，每份250mL。凍干產品，每件取一支防入無菌的三角瓶中，加無菌液體培養液，溶解混勻后分成兩份，每份50mL。貼上抽樣標簽和封條（一份被抽樣單位留存，一份交檢測中心檢測）。

7 檢驗方法

7.1 儀器設備及試劑

7.1.1 儀器設備

生物顯微鏡（ 10×100）；

菌落計數器；

恒溫培養箱；

恒溫干燥箱；

恒溫搖床；

滅菌鍋；

無菌室或超凈工作臺；

酸度計；

試管：ф 15mm×150mm，ф18mm×180mm；

培養皿：直徑 9cm；

三角瓶： 500mL；

無菌吸管： 1、2、5、10mL；

玻璃刮刀；

濾紙；

酒精燈；

標準篩：孔徑 0.18mm和0.15mm；

1號羊毛畫筆；

無菌水；

無離子水。

7.1.2 試劑

選擇培養基（附錄 A）；

剛果紅染液（ 0.5%）。

7.2 成品檢驗

7.2.1 氣味檢驗

取固氮菌肥料樣品打開包裝，進行感官檢驗。

7.2.2 外觀檢驗

將固體固氮菌肥料包裝打開，裝在白色搪瓷盤中，將液體固氮菌肥料搖勻，在明亮光線下進行感官檢驗。

7.2.3 pH值測定

液體固氮菌肥料的 pH值測定：取供檢菌液直接測定pH值，取三次測定結果的平均數。

固體固氮菌肥料的 pH值測定：取50mL燒杯一個，加入菌肥25g，無離子水25mL。通過磁力攪拌使溶液均勻后用酸度計測定pH值。取三次測定結果的平均數。

7.2.4 含水量測定

稱取固體固氮菌肥料三份，每份 20.00g，精確到0.01g，放入已稱恒重的鋁盒中。置105℃干燥箱內烘烤4h，移至干燥器內，冷卻后稱重。根據烘干前后質量差按式(l)計算含水量。取三個樣品測定數的平均值。平行樣品絕對偏差應低于1%。

含水量 (%)=（m 0 -m 1 ）/m 0 ×100                       ………………(1)

式中： m 0 一烘干前樣品質量，g

      m 1 一烘干后樣品質量，g。

7.2.5 吸附劑顆粒細度測定

稱樣 10.00g(精確至0.01g)，置于標準篩中(直徑分別為0.18mm和0.15mm)，用水沖洗，用毛筆輕刷，至粉末不再通過為止。將篩余物置105~110℃溫度下烘干，稱重。篩余物百分含量按式(2)計算：

篩余物 (%)=篩余物質量/（1-樣品含水量百分數）/樣品質量×100 ………(2)

7.2.6 有效活菌數及雜菌率的測定

采用平板計數法測定固氮菌活菌數及雜菌率。

采樣應不少于 500g，從中抽取10.00g，加入帶玻璃珠的100mL的無菌水中(液體菌劑取l0mL加入90mL的無菌水中)，靜置20min后在旋轉式搖床上200r/min充分振蕩30min，即成母液的菌懸液。

用無菌吸管分別吸取 5mL上述母液的菌懸液加入45mL無菌水中，混勻成1：10稀釋的菌懸液，這樣依次稀釋，分別得到1：1×10 2 ，1：1×10 3 ，1：1×10 4 ，1：1×10 5 等濃度（每個稀釋度必須更換無菌吸管）。

用 0.5mL無菌吸管分別吸取不同稀釋度菌懸液0.1mL，加至直徑為9cm的選擇培養基（見附錄A）表面，用無菌玻璃刮刀將菌懸液均勻地涂于瓊脂表面，或取1mL不同稀釋度菌懸液加入培養皿內，與瓊脂培養基混勻，每個樣品取3個連續適宜稀釋度，每一稀釋度重復3次，同時加無菌水的空白對照。28℃培養2~3d后每個稀釋度取5~10個菌落的菌體，涂片染色（見附錄B）。顯微鏡觀察識別后，選一個適宜稀釋度（菌落在30~300個之間的平板），計算出同一稀釋度三個平皿上菌落平均數。

雜菌數是指在選擇培養基上，除有效活菌外的其他種菌的菌落數與馬丁培養基上霉菌數之和。馬丁培養基 10-4稀釋度菌懸液加樣，操作步驟同樣品有效活菌數檢測操作。

7.2.6.2 允許差

平行樣品誤差按式（ 3）計算，并應符合表2的規定。

……………… (3)

                表2 平板上菌落數對應的單一標準差

7.2.6.3 測定結果的計算

按式（ 4）、式（5）計算樣品的有效活菌數及雜菌率

有效活菌數（個 /g）=菌落平均數×稀釋倍數×母液菌懸液的體積/菌劑克數或毫升數/加樣量 …………(4)

雜菌率 (%)=雜菌總數/（固氮菌數+雜菌總數）×100              …………………(5)

7.2.7有效期檢驗

在產品說明書標明的有效期到達前 10d測定成品各項指標，方法同7.2.1 ~ 7.2.6。

8 檢驗規則

8.1 檢驗分類

8.1.1 產品出廠檢驗

產品交貨時進行的檢驗。

8.1.2 產品型式檢驗

新產品鑒定或國家質檢機構質量監督檢驗。

8.2 檢驗項目

型式檢驗的檢驗項目按 5.2要求進行。出廠檢驗不檢有效期。

8.3 判定規則

8.3.1 合格產品:

a)       檢驗結果符合 5.2所規定的技術指標的產品為合格產品；

b)       產品有效活菌數符合指標，雜菌率不符合指標，但小于本標準規定的兩倍時（液體 10%、固體30%、凍干瓶4%），而且在馬丁培養基平板上霉菌數小于30×10 -5 ，其他指標有一項不符合，也可判為合格產品；

c)       產品有效活菌數及雜菌率符合指標，在水分、外觀、 pH值、細度等次要檢測項目中，有3項不符合技術指標，也判為合格產品。

8.3.2 不合格產品:

a)        產品有效活菌數不符合技術指標或投入菌種沒有完全相應的檢驗出，判為不合格產品；

b)        產品雜菌率超過本標準規定的兩倍（液體 10%、固體30%、凍干瓶4%），判為不合格品；

c)        產品有效活菌數符合指標，雜菌率不符合指標，但小于本標準規定的兩倍時（液體 10%、固體30%、凍干瓶4%），其他指標有兩項不符合，判為不合格產品；

d)        產品檢驗在馬丁培養基平板上霉菌數≥ 30×10 -5 ，判為不合格產品；

e)        產品水分、 pH值、細度、外觀等次要檢測項目中，有4項不符合技術指標，判為不合格產品。

8.3.3 含有植物促生根際細菌（PGPR）的固氮菌肥料產品檢測時，只測固氮菌數量，不測植物促生根際細菌的數量，也不視其為雜菌。

8.3.4 本標準中質量指標合格判斷，采用GB/T 1250中修約值比較。

9 包裝、標識、運輸和貯存

9.1 包裝

9.1.1 內包裝

液體肥料小包裝用塑料瓶或玻璃瓶，大包裝用塑料桶。固體肥料用不透明聚乙烯塑料袋包裝。凍干菌劑用玻璃指形管真空干燥。

9.1.2 外包裝

外包裝采用紙箱，紙箱質量應符合 GB/T 6543要求。箱外用尼龍打包帶加固。

9.1.3 每箱(袋)產品中附有產品合格證和使用說明書，在使用說明中標明使用方法、用量及注意事項。

9.2 標識

在包裝箱 (袋)上印有產品名稱、商標、標準編號、肥料登記證號、生產單位、廠址、生產日期、批號和凈重，并印有防曬、防潮、防凍等標記，若有必要還要加印易碎、防倒置等標記。內包裝上有產品名稱、商標、標準編號、肥料登記證號、有效菌含量、生產日期、有效期、產品性能、使用說明書及生產單位、廠址等。

9.3 運輸

適用于常用運輸工具，運輸過程中有遮蓋物，防止雨淋、日曬及 35℃以上高溫。氣溫低于0℃時采取保溫措施，防止菌肥凍冰。運輸過程中輕裝輕卸，避免包裝破損。

9.4 貯存

產品貯存在陰涼、干燥、通風的庫房內，最適溫度為 10℃ ~ 25℃，不得露天堆放，以防雨淋和日曬，避免凍冰及長時間35℃以上高溫。

附錄 A

(標準的附錄)

有效活菌數和雜菌（霉菌）測定的選擇培養基

A1、固氮菌用阿須貝（Ashby）培養基

磷酸二氫鉀（ KH 2 PO 4 ） 0.2g

硫酸鎂（ MgSO 4 ?7H 2 O） 0.2g

氯化納 (NaCl) 0.2g

碳酸鈣 (CaC0 3 ) 5.0g

甘露醇（ C 6 H 14 O 6 ） 10.0g

硫酸鈣 (CaS0 4 ?7H 2 O) 0.lg

pH值 7.0

A2、固氮（莖瘤）根瘤菌培養基

乳酸鈉（ C 3 H 5 O 3 Na） 10.0g

磷酸氫二鉀（ K 2 HPO 4 ） 1.67g

磷酸二氫鉀（ KH 2 PO 4 ） 0.87g

氯化納 (NaCl) 0.05g

氯化鈣 (CaCl 2 ) 0.04g

氯化鐵 (FeCl 3 ) 0.004g

硫酸鎂 (MgS0 4 ?7H 2 0) 0.1g

酵母膏 1.0g

（或酵母粉 0.8g）

pH 6.8

A3、聯合固氮菌培養基

D-葡萄糖酸鈉（C 6 H 11 O 7 Na） 5.0g

磷酸二氫鉀（ KH 2 PO 4 ） 0.4g

磷酸氫二鉀（ K 2 HPO 4 ） 0.1g

硫酸鎂 (MgS0 4 ?7H 2 0) 0.2g

氯化納 (NaCl) 0.1g

氯化鈣 (CaCl 2 ) 0.02g

氯化鐵 (FeCl 3 ) 0.01g

硫酸鎂 (MgS0 4 ?7H 2 0) 0.1g

酵母膏 1.0g

（或酵母粉 0.8g）

鉬酸鈉 (Na 2 Mo0 4 ) 0.002g

pH 6.8~7.0

A4、馬丁培養基（測霉菌數）

磷酸氫二鉀（ K 2 HPO 4 ） 1.0g

硫酸鎂 (MgS0 4 ?7H 2 0) 0.5g

葡萄糖（ C 6 H 12 O 6 ?H 2 0） 10.0g

蛋白胨 5.0g

1%孟加拉紅水溶液 3.3mL

[四氯四碘熒光素（C 20 H 4 Cl 4 I 4 O 5 ）]

每升培養基中加入 0.1g氯霉素，一起滅菌。

注：以上各培養基需蒸餾水 1000mL，瓊脂18 ~ 20g。

附錄 B

（標準的附錄）

染色劑和染色方法

B1 莢膜染色法

B1.1 染色劑

石碳酸復紅染色液

甲液：堿性復紅 (Basicfuchsin)(C 20 H 20 ClN 3 ) 0.3g

95%酒精 10.0mL

乙液：石碳酸（ C 6 H 5 OH） 5.0g

蒸餾水 95.0mL

a）將堿性復紅在研缽中研磨后，逐漸加入95%酒精，繼續研磨使之溶解，配成甲液。

b）將石碳酸溶解在蒸餾水中配成乙液。

c）將甲液和乙液混合搖勻，成為石碳酸復紅，通常可將混合液稀釋5~10倍使用。稀釋液容易變質失效，一次不宜多配。

B1.2 染色方法

B1.2.1 取少量培養菌液涂于載玻片水滴中，涂成薄層。

B1.2.2 自然干燥或稍加熱。

B1.2.3 在石碳酸復紅染1min后，水洗，干后鏡檢。

B1.3 染色結果

菌體為紅色，菌體周圍有一層透明圈即為莢膜。

B2 芽胞染色法

B2.1 染色劑

B2.1.1 5%孔雀綠

孔雀綠（ C 23 H 25 ClN 2 ） 5.0g

蒸餾水 100mL

B2.1.2 0.05%堿性復紅

堿性復紅 (Basicfuchsin)(C 20 H 20 ClN 3 ) 0.5g

95%酒精 100mL

B2.2 染色方法

B2.2.1 制片

B2.2.2 加孔雀綠染液3~5滴于涂片處，酒精燈火焰加熱至冒汽，但不沸騰，并隨時補加染液，維持涂片處不干，染色約5~10min。

B2.2.3 自來水沖洗30s。

B2.2.4 用0.05%堿性復紅染色1min，水洗，鏡檢（若0.05%堿性復紅濃度太高，可根據具體情況適當稀釋）。

B2.3 染色結果

芽胞綠色，菌體紅色。

B3 革蘭氏染色法

B3.1 染色劑

B3.1.1 結晶紫染色液

甲液：結晶紫 2g

乙醇 (95%) 20mL

乙液：草酸鍍 0.8g

蒸餾水 80mL

甲、乙液相混合，靜置 48h后使用。

B3.1.2 盧哥(Lugol)氏碘液

碘 (I 2 )片 1.0g

碘化鉀 (KI) 2.0g

蒸餾水 300mL

先用少量 (3~5mL)蒸餾水溶解碘化鉀，再投入碘片，待碘全溶后，加水100mL，配成母液，使用時加兩倍水，稀釋成盧哥氏碘液。

B3.1.3 脫色液(95%的乙醇)

B3.1.4 復染液(0.5%的番紅水溶液)

取 2.5g番紅，溶于l00mL無水酒精中。取番紅酒精溶液20mL，加入80mL蒸餾水，即成0.5%的番紅水溶液。

B3.2 染色方法

B3.2.1 制片

B3.2.2滴加結晶紫液，覆蓋1min。

B3.2.3 用水沖凈結晶紫液。

B3.2.4 滴加碘液沖去殘水，并覆蓋約1min。

B3.2.5 用水沖去碘液，用吸水紙吸去水分。

B3.2.6 加95%酒精數滴，并輕輕搖動進行脫色，30s后水洗，吸去水分。

B3.2.7 番紅染色液染10s后，自來水沖洗。干燥，鏡檢。

B3.3 染色結果

革蘭氏正反應菌體呈紫色，負反應菌體呈紅色。

B4 鞭毛染色

B4.1 染色劑

甲液：單寧酸（ C 76 H 52 O 46 ） 5.0g

氯化鐵（ FeCl 3 ） 1.5g

15%甲醛（HCHO） 2.0mL

1%氫氧化鈉（NaOH） 1.0mL

蒸餾水 100mL

乙液：硝酸銀（ AgNO 3 ） 2g

蒸餾水 100mL

待硝酸銀溶解后，取出 10mL備用，其余的90mL硝酸銀液中滴加濃氫氧化銨，則形成很厚的沉淀，再繼續滴加氫氧化銨到剛剛溶解沉淀成為澄清溶液為止。再將備用的硝酸銀慢慢滴入，則出現薄霧，但輕輕搖動后，薄霧狀的沉淀又消失，再滴入硝酸銀，直到搖動后，仍呈現輕微而穩定的薄霧狀沉淀為止（如霧重，則銀鹽沉淀出，不宜使用）。

B4.2 染色方法

B4.2.1 涂片：在載玻片的一端滴一滴蒸餾水，用接種環挑取斜面上少許菌苔，在載玻片的水滴中輕蘸幾下。將玻片稍傾斜，使菌液隨水滴緩慢流到另一端，然后平放在空氣中干燥。

B4.2.2 涂片干燥后，滴加甲液3~5min，用蒸餾水沖洗。加乙液染30~60s，并在酒精燈上加熱，使其稍冒汽而染液不干，然后用蒸餾水沖洗，干后鏡檢。

B4.3 染色結果

菌體為深褐色，鞭毛為褐色。

【發表評論】【打印本文】【關閉本頁】【大中小】

相關信息

版權聲明：

1.本(ben)欄目(mu)為(wei)純公益性(xing)欄目(mu)，無任何商業目(mu)的(de)。因部(bu)分文章來源于網(wang)絡，若單(dan)位或(huo)個人不(bu)同(tong)意刊載您的(de)信息請速與本(ben)站聯系，我(wo)們將盡快按您的(de)要求修改(gai)或(huo)刪除。

2.凡本網注明“來源：XXX（非農資網）”的作品，均轉載自其它媒體，轉載目的在于傳遞更多信息，并不代表本網贊同其觀點和對其真實性負責。其版權為資料提供者和原作者所有。

3.本(ben)站不保證為(wei)向(xiang)用(yong)戶提供便(bian)利而設(she)置的外部鏈接的準確性和(he)完(wan)整性。如因作(zuo)品內(nei)容、版權和(he)其它問題需要同本(ben)網聯系(xi)的，請在30日內(nei)進(jin)行(xing)。聯系(xi)電話：0371-63563137

交换的一天电影完整播放在线观看,无码欧美精品一区二区免费式影视,国产成人无码av,((丰满老女人》伦理hd,精品国产青草久久久久福利